Bacillus cereus'e detekteerimine

Otsekülvi meetod

B. cereus'e isoleerimiseks kasutatakse mannitooli-manurebu-polümüksiini agarit ja 5% vereagarit. Agarplaadid inkubeeritakse 30 kraadi juures 48 tundi. Tegemist on otsekülvi meetodiga, mis põhineb pesa moodustavate ühikute (PMÜ) arvul. Meetod eeldab suspensioonilahuse olemasolu ja seeria kümnekordsete lahjenduste tegemist ning lahjenduste kandmist agarplaatidele. Pärast inkubatsiooni otsitavate mikroorganismide jaoks ettenähtud temperatuuridel loendatakse iseloomulike tunnustega kolooniad. Tõelise (proovis tegelikult esindatud) PMÜ numbri saab tuletada loendatud kolooniate arvust, arvestades inokulaadi mahtu ning lahjendusastet. Seda meetodit kasutatakse tavaliselt mikroobigruppide loendamiseks, mida harilikult leitakse >100 g–1 või cm2 kohta.

Adenosiintrifosfaadi (ATP) määramise meetodid

Kõik rakud sisaldavad ATP-d ja selle määramine põhineb ensüüm lutsiferaasi poolt katalüüsitava lutsife­riini poolt valguse produktsioonil, mis võimaldab ATP olemasolu ning kogust registreerida. Reaktsioon toimub minutitega ja seda võib kasutada kiire hügieeni­testina, kus ATP esinemine toidutöötlusruumides on ebaadekvaatse sanitatsiooni (puhastamine, pesemine, desinfitseerimine) selgeks näitajaks. ATP sondeerimist on võimalik kasutada ka bakterite arvukuse määramisel. Selle meetodi puhul lüüsi­takse kõigepealt loomse või taimse päritoluga rakud ning inaktiveeritakse vabane­nud ATP. Seejärel lüüsitakse bakterirakud ning määratakse kindlaks nendest vaba­nenud ATP, mille kontsentratsioon on proportsionaalne analüüsitavas piirkonnas olnud bakterite arvuga. Kaubanduses on saadaval mitmeid hügieeni kontrollsüsteeme, mis põhinevad ATP kindlakstegemisel (Unilite®, Systemsure®, Biprobe® ja Hylite®).

Elektritakistuse muutumisel baseeruvad meetodid ehk impedantsmeetodid

Impedantsmeetodid võimaldavad suhteliselt kiiret mikroorganismide kindlaks­tegemist ning kvantifitseerimist. Meetodi põhimõtteks on mikroobide algse meta­boolse aktiivsuse mõõtmine ning inkubatsiooni ajal bakterite poolt esile kutsutud söötmete elektriliste omaduste muutuste kvantifitseerimine. Selle meeto­diga kaas­neb selge pöördeline lineaarne korrelatsioon proovis esinevate mikroorga­nismide arvu ning nende kindlaksmääramise aja (aeg, mis kulub impedantsi kõvera tek­keks) vahel. Seda tehnikat on võimalik automatiseerida ja nii saab üheaegselt käidelda mitu proovi. Kaubanduses on saadaval eri süsteeme (Bactometer®, Bac Trac®, Malthus®, Rabit®). Kasutades õiget selektiivsöödet ja ettenähtud inkubat­sioonitingimusi, on võimalik impedantsmeetodiga määrata mitme toidupatogee­ni arvukust toidus. Analüüsitavas proovis esinevate elusate organismide loendamiseks tuleb interpoleerida (funkt­siooni antud väärtuste alusel tema vahepealseid väärtusi arvutama) eelnevalt määratud elusrakkude arvukuse (TVC – Total Viable Count) standardkalibreeri­mise kõverat versus sihtmärk-organismi detekteerimise aeg.

Immunoloogilised meetodid

Need meetodid on väga kõrge spetsiifilisusega, põhinevad antikehade sidumisel bakteriraku pinna spetsiifiliste antigeenidega ja on enamasti kasutusel patogeensete bakterite identifitseerimiseks. Seroloogilisi meetodeid kasutatakse:

  1. tahkel agarsöötmel kasvavate bakterikolooniate testimiseks, näiteks eseme­klaasil teostatav aglutinatsioonitest salmonellade jaoks, millel eristatakse rohkem kui 3000 serotüüpi;
  2. organismide avastamiseks kas selektiivsetest või mitteselektiivsetest vedelsööt­metest, näiteks kasutades ELISA-meetodit, mille puhul on tegemist erinevate võimalike versioonidega ning kommertsiaalselt on saadaval ka mitmed ELISA-kitid. ELISA annab tulemuse, mis on võrreldav konventsionaalse kultiveerimise meetodiga, kuid on vähem efektiivne suurel arvukusel konkurentsmikrofloora esinemisel. Valepositiivsed tulemused võivad tekkida juhtudel, kus teatud pinna­antigeenid on samased nii patogeenidel kui mittepatogeenidel (nt salmonellad ja tsitrobakterid). ELISA-t saab kasutada ka Bacillus cereus’e toksiinide avastamiseks.

Patogeensete bakterite ja nende toksiinide määramiseks on kaubanduses saadaval mitmeid automatiseeritud ELISA-süsteeme (nt Vidas®, EIAFoss®, Minilyser®, AutoEIA®).

DNA-l põhinevad meetodid

DNA-l põhinevad meetodid on väga spetsiifilised, kuid nende puuduseks on see, et nad pole võimelised eristama elusrakke surnutest. Samuti on proovi ettevalmistamine aega ja kogemust nõudev ning analüüsiks on vajalik “puhta” proovi olemasolu. Tavakasutuses olevad tehnikad sisaldavad DNA hübridisatsiooni ja polümeraasahelreaktsiooni (PCR). Kaubanduses on saadaval kitte, mis võimaldavad määrata enim tuntud toidupato­geene. DNA hübridisatsioonil on vajalik eelrikastamine, et puljongis või memb­raanfiltritel tekiks küllaldane arv patogeene. Seejärel bakterirakud lüüsitakse ja DNA fikseeritakse filtrile. Märgistatud DNA-sondil lastakse reageerida (hübridi­seeruda) fikseeritud DNA-ga. Pärast mittehübridiseerunud DNA väljapesemist määratakse kindlaks reaktsiooniprodukt. Antud juhul, kasutades dip-stick-tehno­loogiat, bakteri märklaud-DNA püütakse kinni ning määratakse ELISA-ga (nt Gene-Trak®). PCR-tehnika on väga spetsiifiline ning kõrge tundlikkusega. Toimub spetsiifiliste geenide amplifitseerimine (kordades paljundamine) ning see metoodi­ka võimaldab määrata ka proovis väga vähesel hulgal esinevaid baktereid. Meetodi puuduseks on see, et teda võivad inhibeerida söötmetes ja toidus esinevad kompo­nendid, nt ensüümid ja hemoglobiini laguproduktid. Kaubanduses on saadaval PCR-l baseeruvad analüüsisüsteemid (nt Du Pont Bax®, Taqman®, Probelia®).

Lisauuringud

  1. Mikroskoopimine. Valgusmikroskoopiat kasutatakse: bakterite identifitseerimiseks, põhinedes nende morfoloogial ja värvus­reakt­sioonil ja otseseks bakterite loendamiseks (eeldab tavaliselt >105 rakku/ml olemasolu).
  2. Värvimise meetodid. Lihtsad meetodid (nt grammeetod) ei võimalda eristada surnud rakke elusatest. Seda probleemi on võimalik osaliselt vältida, kasutades otsest epifluorestsents-filtertehnikat (DEFT – Direct Epifluorescent Filter Technique). Meetod baseerub sobilikul fluorestsentsil surnud ja elusbakterite erineval värvumisel. DEFT-tehnika võimaldab spetsiifilist bakteritest patogeenide antikehade (mis reageerivad bakteriraku pinnaantigeenidega) fluorestsentsmärgis­tamist.

« Eelmine | Järgmine »